康定傑助理研究員於民國106年5月14日至6月12日(共計30日)，前往日本茨城縣筑波市的國立研究開發法人農業、食品產業技術總合研究所，生物機能利用研究部，動物機能研究領域之動物生殖機能單位。跟隨Kikuchi Kazuhiro博士(首席研究員)及Tamas Somfai博士(研究員)，進行豬隻體外生產系統(in vitro production system)、未成熟卵母細胞(immature oocyte vitrification)及公豬附睪採精技術(epididymis sperm collection)研究。透過Kikuchi Kazuhiro博士的安排與規劃，先由實驗室的Dang Nguyen Quang Thanh博士、Nguyen Thi Men博士及Nguyen Thi Hiep女士進行操作示範。我們先觀察並記錄方法，緊接著在其監督下，進行實地操作。 豬體外生產系統試驗，總共進行3次重複，共使用346顆卵母細胞進行體外培養。卵母細胞經過2階段，合計46小時的體外成熟(in vitro maturation, IVM)培養後，旋即進行體外授精(in vitro fertilization, IVF)。體外授精的精子來源為梅山豬之冷凍解凍(Meishan, M26-2, 5125E)附睪精液。授精精子濃度為1 X 105 spermatozoa/100 µL。IVF後3小時，將胚移入第一階段體外培養(in vitro culture, IVC)液中培養，並於IVF後10小時，使用1% orcein染色觀察原核(pronuclear)形成及多精入卵(polyspermy)的情況。試驗結果顯示正常受精率(monospermy)為51.3±3.1%，多精入卵率為12.7±3.5%。IVF後第2天移入第二階段IVC培養液中繼續培養，在IVF後的第6天進行囊胚形成觀察及Hoechst 33342染色，計算囊胚細胞數。結果顯示第6天囊胚率為11.8±1.7% (% cultured)，囊胚細胞數平均為47.7±2.5個。 豬隻卵母細胞冷凍技術是由Tamas Somfai博士親自指導。豬未成熟卵母細胞經由冷凍解凍後，續進行體外成熟、體外授精及體外培養，最後移植且成功生下小豬的之全世界首例文獻報告，便是出自Tamas Somfai博士之手。卵母細胞收集完畢後，直接進行玻璃化冷凍。Tamas Somfai博士示範了microdrop及cryotop兩種方式的玻璃化冷凍技術；其中，microdrop是無載體的玻璃化冷凍方式，而cryotop則需要一個特殊載體進行。兩者所使用之冷凍保護劑成分並無差異。本次共使用330顆未成熟卵母細胞進行玻璃化冷凍試驗。經玻璃化冷凍後之未成熟卵母細胞，於冷凍2天後解凍，並進行後續IVM培養。經過IVM培養46小時後，利用玻尿酸酶將卵丘細胞移除，續進行fluorescein diacetate (FDA)染色。FDA可利用UV及GFP-II濾鏡(MZ15FA; Leica Micro-system, Heerbrugg, Switzerland)觀察卵母細胞死活，活細胞在細胞質處，會顯現明亮的綠色螢光，死亡者則無色。結果顯示，卵母細胞冷凍解凍後之平均存活率為87.3±7.5% v.s 87.65±6.2% (microdrop v.s cryotop)。 在日本，要取得成年公豬睪丸機會並不多，本次在Kikuchi Kazuhiro博士努力下，取得一對豬睪丸，我們才得以成功學到附睪採精的技術。過程中，操作環境的溫度盡可能須維持在攝氏37度。操作時先以手術刀及剪刀將附睪與睪丸分離，將輸精管與附睪間的繫膜剪開，以利精子之收集。再將準備好之50 mL離心管接住輸精管端口，另一端接上18G平針針頭，以束帶將之束緊，以50 mL 針筒灌入空氣將精液往輸精管端沖出。隨即將精子移入攝氏15度的冷房中平衡2-3 小時。並調整每劑精子濃度為250 X 106 spermatozoa之後，以攝氏15度，3000 RPM，10 min離心。移除上層液後，小心加入第一階段稀釋液(NSF-I)。於攝氏5度平衡2-3 h後，添加等體積之第二階段稀釋液(含6% glycerol)，隨即裝填入0.25 mL straw中(最終glycerol濃度為3%)，封粉後以一階段冷凍法(液態氮液面上4 cm，10 min)予以冷凍。總計生產326支0.25 mL麥管之冷凍精液。 本次赴日本進行為期30天的研究，藉由專家示範、經驗即時傳授以及親自實際操作，得到的記憶非常深刻。亦可很清楚比較出與我們現行方法的細微差異。有疑問時及時提問，很多時候真的有豁然開朗的感覺。在此，非常感謝 Kikuchi Kazuhiro博士、Tamas Somfair博士及實驗室Dr. Dang Nguyen Quang Thanh博士、 Nguyen Thi Men博士及Nguyen Thi Hiep女士等人鼎力協助，讓這次赴日的短暫研究能夠有豐碩的成果。返台後首要之急便是將日本所學，先成功複製並建立系統，待系統穩定後再行改進，使其效能可以更加提升。